振荡遗传回路：微生物组的可靠时钟

随着时间的流逝，取决于每个菌落的种子细菌开始生长时，再抑菌回路所处的阶段，含有再抑菌回路的细菌菌落会形成不同的“生长环”模式。

尽管人类微生物组在过去几年中受到了人们的广泛关注，但这种研究的一个方面很少成为头条新闻：难以观察其随各种刺激而随时间变化的情况。最常见的分析方法是从粪便样本中提取细菌，然后对它们的基因组进行测序，但是这种方法虽然具有微创性，但会丢失有关肠道中细菌发生的位置和时间的重要信息，从而为科学家提供了关于肠道动态的不完整信息。微生物组。

现在，由哈佛大学怀斯生物启发工程研究所和哈佛医学院（HMS）的研究人员创建的一种新工具以一组细菌基因的形式提供了解决此问题的方法，这些细菌基因被设计用来检测和记录变化随着时间的流逝，活细胞小鼠肠道中不同细菌群的生长会随着时间的增长而变化，并且可以作为基于合成生物学的复杂诊断和治疗方法的平台，用于肠道中的各种应用。该研究于2019年10月11日发表在《自然通讯》上。

保持时间

该系统使用振荡基因电路（称为再加压器）作为一种测量细菌生长的遗传钟。该再调控因子由三个细菌基因组成，这些细菌基因编码三种蛋白质（tetR，cl和lacI），每种蛋白质均阻断其他一种蛋白质的表达。这些基因被链接到一个负反馈回路中，因此当一种阻遏蛋白的浓度降低到一定水平以下时，其被阻遏的蛋白就会被表达，从而阻止了第三种蛋白的表达，并且重复该过程。一种周期性的方式。

该时移的gif显示了在细菌菌落的生长过程中，随着再加压循环的进行，荧光环的模式如何变化。

当将所有三个基因都插入质粒并引入细菌后，完成的负反馈循环次数可以作为细菌经过多少次细胞切割的记录。每次细菌沉淀时，存在于细胞质中的任何阻遏蛋白都会被稀释，因此它们的浓度会逐渐下降并触发阻遏蛋白循环中下一个蛋白的表达。至关重要的是，无论细菌生长有多快或多慢，在15.5个细菌世代之后，重复加压循环都将重复。这使其可以像时钟或手表一样用作客观的时间量度。

“想像一下，如果您有两个人戴着两个不同的手表，而一个人的手表上的第二只手的运动速度是另一个人的两倍，”第一作者戴维·里格拉尔（David Riglar）博士解释道，他曾是威斯研究所（Wyss Institute）的前博士后和HMS现在是伦敦帝国理工学院的研究小组的亨利·戴尔爵士（Henry Dale Fellow）爵士。“如果您在一小时后停下这两只手表，它们将不会同意现在的时间，因为它们的时间量度会根据秒针的运动速度而变化。相比之下，我们的稳压器就像一块手表，始终以相同的速度运转，因此，无论有多少人佩戴，它们都将提供一致的时间度量。这种质量使我们能够更精确地研究肠道中细菌的行为。”

研究人员将这三种阻抑蛋白中的每一种与不同颜色的荧光分子偶联，并开发了一种称为RINGS（单细胞水平基于阻抑剂的生长推断）的成像工作流程，以追踪细菌生长过程中不同时间点表达的蛋白。赖格拉尔说：“随着细菌菌落的向外生长，阻遏物回路产生了这些不同的荧光，树环状特征，基于这些阻遏蛋白在起始菌落的单一细菌中具有活性。”“荧光环的模式记录了自开始生长以来已经发生了多少次再加压循环，我们可以分析该模式以研究不同细菌在不同环境中的生长速率如何变化。”

通过使用RINGS，该团队能够成功追踪体外生长的几种不同细菌物种的细胞切割，并观察到当细菌在小鼠肠道提取的样品上生长（模拟复杂的微环境）时，细菌的再加压周期的长度保持一致。或暴露于抗生素（以模拟压力条件和不一致的生长方式）。

该视觉示意图跟踪了随时间推移的单个细菌样本中的阻遏物循环：每种阻遏物蛋白的表达都由不同的荧光色表示。

为了评估增效剂在体内的性能，研究小组向小鼠口服了含有增效剂回路的大肠杆菌，然后分析了从粪便样品中提取的细菌。引入后，该稳压器保持活跃状态​​长达16天，这表明在活体哺乳动物中，肠道细菌中可以维持长期的振荡基因表达。RINGS分析成功地检测出细菌生长方式的变化，并且通过给小鼠提供一种在其饮用水中阻止了再呼吸机循环的化合物，可以使“再呼吸机”处于不同阶段的细菌“同步”。

最后，研究人员测试了调节器检测肠道炎症引起的细菌生长速率差异的能力。给小鼠一种诱导炎症的化合物，然后给其加载再加压剂的细菌。15小时后，RINGS分析显示，与对照组小鼠相比，发炎小鼠的细菌具有更广泛的阶段性加压素，这表明炎症产生的环境会驱动细菌生长不一致，从而可能导致肠道微生物组失衡。 。

核心作者之一帕梅拉·西尔弗（Pamela Silver）博士说：“这种再呼吸器使我们能够真正探查活肠中细菌行为的复杂性，不仅在健康和患病状态下，而且在时空上都如此。” Wyss研究所的成员，HMS的Elliot T.和Onie H. Adams生物化学与系统生物学教授。“事实上，我们可以在肠道内已经存在的时候重新同步再加压器，并且无需施用选择性抗生素就可以维持再加压器，这也意味着我们可以以更自然的状态研究微生物组，将干扰降到最低。”

除了了解微生物组的动力学，再加压器还为人类肠道释放了基于合成生物学的复杂诊断和治疗方法的潜力。潜在的应用包括创建一个系统，该系统被编程为在昼夜节律的某个点启动基因转录级联，或诊断记录在检测到给定生物标记后已经过去了多少时间的诊断程序。

Wyss创办人唐纳德·英格伯（Donald Ingber）表示：“这项研究不仅解决了与监测肠道内微生物组生理动态变化有关的特定问题，而且还提供了一个平台，可以带来全新的诊断方法，甚至是时间依赖的治疗方法。” ，医学博士，博士，同时还是HMS和波士顿儿童医院血管生物学计划的Judah Folkman教授，以及哈佛大学约翰·保尔森工程与应用科学学院的生物工程学教授。

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该论文的其他作者包括HMS的David Richmond，Laurent Potvin-Trottier，Andrew Verdegaal，Somenath Bakshi，Emanuele Leoncini，Lorena Lyon和Johan Paulsson，以及Wyss Institute，HMS的Alexander Naydich和哈佛大学的John A. Paulson学校。工程与应用科学。这项研究得到了人类前沿科学计划的长期奖学金，孟席斯基金会，惠康基金会，国家科学基金会，国防高级研究计划局，哈佛医学院和怀斯生物启发工程研究所的支持。

参考：David T. Riglar，David L. Richmond，Laurent Potvin-Trottier，Andrew A. Verdegaal，Alexander D. Naydich，Somenath Bakshi，Emanuele Leoncini，Lorena G撰写的“单细胞合成振荡器捕获的哺乳动物肠道中的细菌变异性”里昂，约翰·鲍尔森和帕梅拉·A·西尔弗，2019年10月11日，《自然通讯》。
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